浅谈Nanopore三代测序技术
条评论第三代测序技术与前两代测序技术相比,其最大的特点就是单分子测序,测序过程无需进行PCR扩增,实现了对每一条DNA分子的单独测序。其中,英国牛津纳米孔公司所开发的纳米孔(Nanopore)测序技术便是三代测序中的中流砥柱。2014年,其推出U盘大小的便携式MinION测序仪,仪器售价仅需$1000,据官网报道最长Reads可长达960Kb。从当前形势来看,一代测序因其准确度高,仍作为突变检测、单菌鉴定等的金标准而存在。以illumina HiSeq为代表的第二代短读长测序技术在测序市场上仍然占有绝对优势,主打低成本和高通量。但第三代测序技术(PacBio与Nanopore)近年来发展很快,主打长读长策略,直击二代测序短序列的软肋,已应用于基因组测序、甲基化研究和突变鉴定等多个研究领域。
Nanopore测序原理
纳米孔测序,顾名思义,核心就是利用一个纳米孔,孔内共价结合有分子接头,将纳米孔蛋白固定在电阻膜上,然后使DNA双链解链成单链,再利用马达蛋白牵引核酸单链穿过纳米孔。当一条核酸链穿过纳米孔时,会对膜两边离子的稳定流动产生扰动,从而引起电阻膜上电流的变化。由于纳米孔的直径非常细小,仅允许单个核苷酸通过,而不同碱基的带电性质不一样,因此不同碱基通过蛋白纳米孔时对电流产生的干扰不同,通过实时监测并解码这些电流信号便可确定碱基序列,从而实现测序。纳米孔是对穿过的片段进行测序,而不管DNA片段的长度如何,而不是生成特定长度的序列,这可能是数百个碱基、或者更多个碱基的序列。Nanopore的长序列简化了重复区域的组装和测序,也提高了物种鉴定和宏基因组实验的速度。
Nanopore测序中的几种物质
- Reader(跨膜蛋白):在自然界中,有一种可以嵌入到细胞膜中作为离子或分子通道的跨膜蛋白,具有天然的蛋白纳米孔。经过人为基因工程修饰后,得到Nanopore测序所需的Reader蛋白。
- Membrane(电阻膜):Reader蛋白会被嵌入到高电阻率的由人工合成的多聚物膜中,膜两侧是离子溶液,在两侧加不同的电位,离子就会在孔中流动,形成电流。
- Motor(马达蛋白):在Nanopore文库构建时,需要在接头上连接一种马达蛋白,用于将DNA或RNA分子推入纳米孔中。以DNA解螺旋酶作为 Motor为例,它除了可以解开双螺旋,使之变为单链,还可以提供推动力。
- Tether:该蛋白用于锚定DNA或RNA链,防止其在溶液中飘动,并使其进入纳米孔中。
Nanopore测序的具体过程?
Nanopore测序是将人工合成的一种多聚物膜浸在离子溶液中,多聚物膜上布满了经改造的穿膜孔的跨膜通道蛋白(纳米孔),也就是Reader蛋白,在膜两侧施加不同的电压产生电压差,DNA链在马达蛋白的牵引下,解螺旋酶将双链DNA解开成单链;DNA单链分子通过一个孔道蛋白,孔道中有个充当转换器的蛋白分子;DNA单分子停留在孔道中,有一些离子通过带来电流变化,而不同的碱基带来的电流变化不同;转化器蛋白分子感受5个碱基的电流变化;根据电流变化的频谱,应用模式识别算法得到碱基序列。
Nanopore测序得到的序列文件的格式也是HDF5,下机产生后缀为Fast5的序列文件。Fast5文件可经由Poretools软件转换为Fastq文件或Fasta,然后进行后续数据分析。应用Poretools将fast5转换为fastq的示例:https://poretools.readthedocs.io/en/latest/content/examples.html#poretools-fastq
Nanopore测序技术的主要优势?
- 长读长:Reads可达Mb;适合进行大片段结构变异的检测或大基因组的拼接。
- 设备成本低:测序芯片可清洗再生,重复利用;
- 实时获得序列信息:最快可在1小时内完成测序流程及数据分析,满足动态检测宏基因组需求;
- 便携式测序装置:重量轻且占用空间小,可以随身携带随时测序;实时快速进行微生物分类鉴定。
- 直接测序:直接测序原始DNA和RNA,不需要进行PCR扩增,避免了扩增偏好性;保留了原始碱基修饰信息,能够直接读出甲基化的胞嘧啶。以往转录组分析由于无法直接对RNA进行测序,往往需要先对mRNA进行打断,再反转录为cDNA,无法获取和分析全长转录本。
文字描述不容易理解,下面通过一个视频,更加直观的展示纳米孔测序。
本文标题:浅谈Nanopore三代测序技术
文章作者:adong
发布时间:2023-01-11
最后更新:2023-01-24
原始链接:https://www.ligene.cn/blog/2023/01/11/Nanopore/
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